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Due to the wide variety of benign and malignant salivary gland tumors, classification and malignant behavior determination based on histomorphological criteria can be difficult and sometimes impossible. Spectroscopical procedures can acquire molecular biological information without destroying the tissue within the measurement processes. Since several tissue preparation procedures exist, our study investigated the impact of these preparations on the chemical composition of healthy and tumorous salivary gland tissue by Fourier-transform infrared (FTIR) microspectroscopy. Sequential tissue cross-sections were prepared from native, formalin-fixed and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue and analyzed. The FFPE cross-sections were dewaxed and remeasured. By using principal component analysis (PCA) combined with a discriminant analysis (DA), robust models for the distinction of sample preparations were built individually for each parotid tissue type. As a result, the PCA-DA model evaluation showed a high similarity between native and formalin-fixed tissues based on their chemical composition. Thus, formalin-fixed tissues are highly representative of the native samples and facilitate a transfer from scientific laboratory analysis into the clinical routine due to their robust nature. Furthermore, the dewaxing of the cross-sections entails the loss of molecular information. Our study successfully demonstrated how FTIR microspectroscopy can be used as a powerful tool within existing clinical workflows.
Die prä-, intra- und postoperative Entitäts- und Dignitätsbestimmung von Speicheldrüsen-tumoren (ST) allein anhand von histomorphologischen Kriterien ist häufig mit großen Unsicherheiten verbunden.
Die Spektren der Raman-Spektroskopie (RS) und der Infrarot-Spektroskopie (IS) enthalten Informationen zu der molekularen Zusammensetzung des untersuchten Gewebes. Ziel der Arbeit war die Etablierung eines Gewebe-Aufarbeitungs-Workflows und die Analyse des Einflusses der Fixierung auf die spektrale Bioinformation. Zudem wird ein Überblick über den Einsatz der RS und IS im Kopf-Hals Bereich gegeben.
Es wurden 10 mm dicke, konsekutive kryo-, formalin- und paraffinfixierte ST-Gewebeschnitte von Zystadenolymphomen (n=5) und pleomorphen Adenomen (n=4) mit der RS und IS untersucht und die Daten multivariat ausgewertet. Die Messungen erfolgten in Korrelation zur Histomorphologie über einen korrespondierenden HE-Schnitt sowohl im Tumorgewebe als auch im gesunden Speicheldrüsengewebe.
In der Mittelwertspektrenanalyse zeigte sich eine deutliche Paraffin-Signatur, Formalin-Fixierung hatte keinen wesentlichen Einfluss. Dies konnte durch die Hauptkomponentenanalyse (PCA) bestätigt werden. Eine Diskriminierung von Tumor- und Nicht-Tumorgewebe durch die PCA und gekoppelte Diskriminanzanalyse war ebenfalls mit beiden spektroskopischen Methoden mit einer hohen Sensitivität möglich.
Für eine Translation von spektralen Verfahren ist das Wissen über Einflussfaktoren auf die spektrale Bioinformation der Gewebeaufarbeitung und -fixierung unabdingbar. Die Integration spektraler Verfahren additiv in bestehende Arbeitsabläufe ist möglich. Der Einfluss der Formalinfixierung auf die spektrale Bioinformation ist gering. Die bioinformatische Analyse der umfangreichen Datensätze ist herausfordernd.
IZKF Würzburg
Salivary gland tumors (SGTs) are a relevant, highly diverse subgroup of head and neck tumors whose entity determination can be difficult. Confocal Raman imaging in combination with multivariate data analysis may possibly support their correct classification. For the analysis of the translational potential of Raman imaging in SGT determination, a multi-stage evaluation process is necessary. By measuring a sample set of Warthin tumor, pleomorphic adenoma and non-tumor salivary gland tissue, Raman data were obtained and a thorough Raman band analysis was performed. This evaluation revealed highly overlapping Raman patterns with only minor spectral differences. Consequently, a principal component analysis (PCA) was calculated and further combined with a discriminant analysis (DA) to enable the best possible distinction. The PCA-DA model was characterized by accuracy, sensitivity, selectivity and precision values above 90% and validated by predicting model-unknown Raman spectra, of which 93% were classified correctly. Thus, we state our PCA-DA to be suitable for parotid tumor and non-salivary salivary gland tissue discrimination and prediction. For evaluation of the translational potential, further validation steps are necessary.
Die prä-, intra- und postoperative Entitäts- und Dignitätsbestimmung von Speicheldrüsen-tumoren (ST) allein anhand von histomorphologischen Kriterien ist nicht in allen Fällen zuverlässig möglich. Die Spektren der Raman-Spektroskopie (RS) enthalten Informationen zur molekularen Zusammensetzung des untersuchten Gewebes. Ziel der Arbeit war die Etablierung eines RS-basierten Mess-Setups und eines Workflows zur Differenzierung von Speicheldrüsentumorgewebe und Speicheldrüsengewebe. Zudem werden die Hürden der Translation von RS in der Speicheldrüsendiagnostik diskutiert. Es wurden 10 mm dicke, native Kryo-Gewebeschnitte von Warthin-Tumoren (n=5) und pleomorphen Adenomen (n=4) mit der RS sowohl im Tumorgewebe als auch im gesunden Speicheldrüsengewebe untersucht und die Daten multivariat ausgewertet. Alle Messungen wurden in einem korrespondierenden HE-Schnitt histomorphologisch lokalisiert. Durch eine "Principal component"-Analyse (PCA) der RS-Daten und gekoppelte Diskriminanzanalyse war sowohl eine Unterscheidung von Tumor- und Nicht-Tumorgewebe als auch die Differenzierung der verschiedenen Tumorentitäten (basierend auf der histopathologischen Begutachtung) mit einer hohen Genauigkeit (93%) möglich. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass anhand der RS-Messungen sicher zwischen ST-gewebe und gesundem Speicheldrüsengewebe unterschieden werden konnte. Ein wichtiges Ergebnis ist ebenfalls, dass die Gewebeaufarbeitung mit pathologischen Standard-Methoden zuverlässig möglich ist. Die hohe Anzahl an verschiedenen ST-Entitäten stellt eine biostatistische Herausforderung dar. Lösungsansätze sind mehrstufige statistische Modelle und die gleichzeitige Korrelation mit histomorphologischen Kriterien.
The pre-, intra- and postoperative determination of the entity and dignity of salivary gland tumors (ST) based solely on histomorphological criteria is not reliably in all cases. The spectra of Raman spectroscopy (RS) contain information about the molecular composition of the examined tissue. The aim of the work was to establish an RS-based measurement setup and a workflow for the differentiation of salivary gland tumor tissue and salivary gland tissue. In addition, the barriers of translating RS in salivary gland diagnostics are discussed. 10 µm thick, native cryo-tissue sections of Warthin tumors (n=5) and pleomorphic adenomas (n=4) were examined using RS in both tumor tissue and healthy salivary gland tissue and the data were evaluated in a multivariate data analysis. All measurements were histomorphologically localized in a corresponding HE section. A "principal component" analysis (PCA) of the RS data and coupled discriminant analysis enabled both a distinction between tumor and non-tumor tissue as well as the differentiation of the various tumor entities (based on the histopathological assessment) with a high level of accuracy (93% ). In summary, it could be shown that the RS measurements could be used to reliably distinguish between ST and healthy salivary gland tissue. Another important result is that tissue processing is possible reliably using standard pathological methods. The high number of different ST entities represents a biostatistical challenge. Approaches to the solution include multi-level statistical models and simultaneous correlation with histomorphological criteria.
